電泳技術(shù)就是利用在電場的作用下,由于待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異,使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度,從而對樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的技術(shù)。 電泳過程必須在一種支持介質(zhì)中進(jìn)行。Tiselius等在1937年進(jìn)行的自由界面電泳沒有固定支持介質(zhì),所以擴散和對流都比較強,影響分離效果。于是出現(xiàn)了固定支持介質(zhì)的電泳,樣品在固定的介質(zhì)中進(jìn)行電泳過程,減少了擴散和對流等干擾作用。
制膠時在凝膠溶液中放一個塑料梳子,在膠聚合后移去,形成上樣品的凹槽。水平式電泳,凝膠鋪在水平的玻璃或塑料板上,用一薄層濕濾紙連接凝膠和電泳緩沖液,或?qū)⒛z直接浸入緩沖液中。由于pH值的改變會引起帶電分子電荷的改變,進(jìn)而影響其電泳遷移的速度,所以電泳過程應(yīng)在適當(dāng)?shù)木彌_液中進(jìn)行的,緩沖液可以保持待分離物的帶電性質(zhì)的穩(wěn)定。
SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳可測定蛋白質(zhì)分子量.其原理是帶大量電荷的SDS結(jié)合到蛋白質(zhì)分子上克服了蛋白質(zhì)分子原有電荷的影響而得到恒定的荷/質(zhì)比。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測蛋白質(zhì)分子量已經(jīng)比較成功,此法測定時間短,分辨率高,所需樣品量極少(1~100μg),但只適用于球形或基本上呈球形的蛋白質(zhì),某些蛋白質(zhì)不易與SDS結(jié)合如木瓜蛋白酶,核糖核酸酶等,此時測定結(jié)果就不準(zhǔn)確.
選擇合適的凝膠濃度,使組分得以充分的分離。通常靠近前沿的蛋白帶分辨率不佳,所以應(yīng)根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關(guān)系,灌制足夠長度的凝膠,以使樣品不會走出前沿。樣品的蛋白水解作用也引起擴散而使分辨率降低。水解作用通常發(fā)生在樣品準(zhǔn)備的時候,系統(tǒng)中的內(nèi)源性蛋白酶會水解樣品蛋白,如果在緩沖液中加蛋白酶抑制劑可以減少這種情況的發(fā)生。