石蠟切片熒光tunel+IF實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡熒光共定位-上海鄭核
一、實(shí)驗(yàn)器材及試劑
1、實(shí)驗(yàn)器材
名稱 廠家 型號(hào)
脫水機(jī) 武漢俊杰電子有限公司 JJ-12J
包埋機(jī) 武漢俊杰電子有限公司 JB-P5
病理切片機(jī) 上海徠卡儀器有限公司 RM2016
凍臺(tái) 武漢俊杰電子有限公司 JB-L5
組織攤片機(jī) 浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司 KD-P
烤箱 上?；厶﹥x器制造有限公司 DHG-9140A
載玻片 Servicebio
蓋玻片 江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司 10212432C
脫色搖床 Servicebio TSY-B
渦旋混合器 Servicebio MX-F
掌上離心機(jī) Servicebio D1008E
移液槍 Dragon KE0003087/KA0056573
組化筆 Gene tech GT1001
正置熒光顯微鏡 日本尼康 Nikon Eclipse C1
成像系統(tǒng) 日本尼康 Nikon DS-U3
2、主要實(shí)驗(yàn)試劑
試劑 廠家 貨號(hào)
無水乙醇 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
二甲苯 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司
PBS緩沖液 Servicebio G0002
破膜液 Servicebio G1204
蛋白酶K Servicebio G1205
BSA Servicebio G5001
Tunel試劑盒 Roche 11684817910
一抗
熒光二抗
DAPI Servicebio G1012
抗熒光淬滅封片劑 Servicebio G1401
二、石蠟切片熒光tunel+熒光實(shí)驗(yàn)步驟
1、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15-20min-二甲苯Ⅱ15-20min-無水乙醇Ⅰ10min-無水乙醇Ⅱ10min-95%酒精5min-90%酒精5min-80%酒精5min-70%酒精5min-蒸餾水洗（冬天脫蠟時(shí)間稍微延長(zhǎng)）。
2、修復(fù)：切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈（防止液體流走），在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37度溫箱孵育25min。將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
3、破膜：切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20min，將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。
4、加試劑1,2：按片子數(shù)量和組織大小取tunel試劑盒內(nèi)適量試劑1 (TdT) 和試劑2(dUTP)按1:9混合，加到圈內(nèi)覆蓋組織，切片平放于濕盒內(nèi)，37℃恒溫箱孵育2小時(shí)，濕盒內(nèi)加少量水保持濕度。
5、BSA封閉:將玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。
6、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于濕盒內(nèi)4°C孵育過夜。（濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
7、加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min。
8、DAPI復(fù)染細(xì)胞核：切片用PBS（PH7.4）洗滌3次，每次5min。去除PBS后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min。
9、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。
10、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。（DAPI紫外激發(fā)波長(zhǎng)330-380nm，發(fā)射波長(zhǎng)420nm，發(fā)藍(lán)光；FITC激發(fā)波長(zhǎng)465-495nm，發(fā)射波長(zhǎng)515-555 nm，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長(zhǎng)510-560，發(fā)射波長(zhǎng)590nm，發(fā)紅光
三．石蠟切片熒光tunel+IF結(jié)果判讀
DAPI染出來的細(xì)胞核在紫外的激發(fā)下為藍(lán)色，tunel試劑盒為FITC熒光素標(biāo)記，陽性凋亡細(xì)胞為綠光，一抗標(biāo)記為紅色。
鄭核生物優(yōu)勢(shì)貨源：麥克林全國(guó)授權(quán)經(jīng)銷商、TCI、阿拉丁、Abcam、CST、三鷹、索萊寶、SIGMA、alfa、ACROS、WAKO、岸田化學(xué)、等試劑；病理實(shí)驗(yàn)的專業(yè)助手，病理切片，HE染色，免疫組化，特殊染色，病理大切片專業(yè)的設(shè)備，有資質(zhì)的人員為大家提供動(dòng)物組織脫水，包埋，制片，染色等病理科研技術(shù)服務(wù)！多組織包埋、切片、he染色、全景掃描
病理分析、masson染色、免疫組化、WB
免疫熒光、RT-PCR、透射電鏡、ELISA
掃描電鏡、生化檢測(cè)收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)私信，真是實(shí)驗(yàn)結(jié)果，公司正規(guī)運(yùn)營(yíng)資質(zhì)可驗(yàn)查，為病理實(shí)驗(yàn)提供有效保障。；優(yōu)勢(shì)產(chǎn)品：Roche、BD、santa、R&D、博士德、博奧森、聯(lián)科、華美、南京建成、Thremo、Millipore、Axygen、NEST、四季青、gibco、百靈威、ELK、abways、BI、bioword、affinity、bioss、欣博盛、PAN、同仁、康為、匯力、天根等;